Pesawat pengeluaran pertama Me 321A-1 memasuki perkhidmatan pada May 1941 dengan Grossraumlastensegler 321 di Leipheim, pada awalnya ditunda oleh Ju 90s dan kemudiannya oleh He 111Z dan tatarajah Troikaschlepp yang terdiri daripada 3 Bf 110s.[3] Versi Me 321B-1 terkemudian mempunyai kakitangan seramai 3 orang dan persenjataan 15 mesingan 4 x 7.9mm MG .

Me 321 kurang berjaya di perbatasan Timur kerana beberapa sebab:

• Sebagai peluncur, Me 321 kekurangan keupayaan untuk membuat cubaab kedua atau ketiga kelandasan sibuk.
• Ia mustahil untuk bergerak di darat tanpa kenderaan khas.
• Sebelum pengenalan He 111 Zwilling tatarajah Troikaschlepp yang merbahaya memberikan jarak satu hala hanya 400 km yang tidak mencukupi bagi zon operasi selamat.[4]

Pada musim bunga 1942 baki Me 321 dikeluarkan dari perkhidmatan di Rusia sebagai persediaan bagi rancangan Operasi Herkules yang dirancang, penjajahan Malta, di mana armada peluncur ditunda oleh He 111Z akan digunakan. Rancangan itu dibatalkan kerana kekurangan pesawat penunda.

Pada tahun 1943, Me 321 kembali beraksi ke Rusia untuk digunakan dalam rancangan operasi untuk membantu tentera Jeneral Paulus' yang terkepong di Stalingrad, tetapi menjelang masa mereka tiba di medan hadapan tidak terdapat lapangan terbang yang sesuai dan mereka dihantar kembali ke Jerman.

Selepas pembatalan operasi Stalingrad, peluncur Me 321 samaada diletak dalam simpanan atau dilupuskan, sungguhpun sesetengah ditukar kepada versi berenjin, Me 323. Cadangan operasi lanjut, di mana baki Me 321 akan mendaratkan tentera di Sicily turut dibatalkan, disebabkan ketiadaan tapak pendaratan yang sesuai.

Akhirnya hanya sekitar 150 Me 321 dihasilkan. Terdapat juga variasi berenjin Me 321, iaitu Me 323 dengan enam enjin 895 kW. Ini merupakan pesawat kargo di daratan terbesar semasa Perang Dunia II.